1. 仪器基本信息
1.1主要部件：传感器、反应仓、钛金属塞、有机玻璃盖、膜工具、Peek 磁力搅拌子、分析软件等
1.2主要技术参数：
玻璃仓容积：6ml
玻璃仓有效体积：1.5-3.5ml
温度范围：2-47℃，
温度稳定性：0.005℃ 90 分钟以后
温度变化速率：20-30℃，15 分钟 ； 30-20℃，20 分钟
温度信号分辨率：0.001℃
流动氧检测限：0.5pmol/s.ml
测试范围：氧气分压 0.01-100kpa
压力分辨率：0.1kpa
搅拌子转速：100-900rpm
噪音：
无氧噪音：0.003Kpa
空气条件下噪音：0.005Kpa
2.样品准备
2.1实验动物中提取的原代细胞或培养的细胞系
制备细胞悬液：
原代细胞：细胞重悬并进行细胞计数，用 Mir05（呼吸介质）进行重悬。
细胞系：消化后进行细胞计数，用细胞培养基进行重悬。
O2k 上样量：
细胞数量根据细胞类型进行调整，例如肝脏细胞0.2*10^6个，血小板 150-400*10^6 个
2.2新鲜组织样本
制备组织匀浆液：
冰上取材后，立刻称重，一般5-10 mg（根据参考文献），其余未称量组织放置在冷的PBS中备用；加入十倍体积的Mir05（参考：10 mg组织加入100μL的介质），并将组织块剪碎；将组织碎块及Mir05一并加入玻璃匀浆器中进行匀浆，得到无组织块的匀浆液即可（其他研磨条件需要摸索，如钢珠匀浆或超声匀浆等）。
O2k 上样量：
每舱3-5 mg组织，即加入30-50μL（根据参考文献）的组织匀浆液。
3.刷卡上机、仪器状态检查
注意观察仪器状态，仪器电压稳定状态一般在2左右；仓内初始氧容量200uM左右
1.1 操作流程及建议参数设置
4.1先开仪器、再开软件：
仪器开关在背面，同时注意打开真空泵的开关。双击OROBOROS DatLab→
37°C set up → load set up. → Connect to oxygraph-2k → 命名保存
(F11/F12分别控制A/B转子转动，F4进行标记)
4.2仓的清洗：
利用真空泵开清洗检测仓。拔塞子不宜过于用力，拔出塞子后倒置。抽吸时，吸液管的尖端不能对着电极一侧，应接触对侧底部（电极对侧即为两个槽子的内侧），将液体尽量抽吸干净，注意不要交换塞子和盖子。
l 三个50 mL离心管内加入纯水，一个加入75%乙醇。
l 开启仪器，开始转动（由于上次实验后仓内充满75%乙醇），5 min后吸去乙醇，再次加入75%乙醇转动清洗5 min，而后重复一次，即共用75%乙醇清洗3次，每次5 min。
l 拔出塞子，用纯水冲洗后放入装满纯水的50 mL离心管内浸泡。同时仓内加满纯水，先不塞塞子，转动清洗5min，重复3次。在此期间，用纯水冲洗浸泡塞子，尽量冲洗干净塞子上的乙醇（乙醇会对实验结果造成影响）。
l 向仓内加入约2.5 mL纯水，然后放入塞子，洗掉溢出的水，然后从塞子上方继续加满水，盖上盖子，转动清洗5 min，然后取出塞子，让水从毛细管内流出。而后重复操作，加塞子加水清洗一般也许3次（根据实验情况而定，若两次实验材料不一样，需要增加清洗时间和次数）。
4.3平衡：
最后一次清洗要尽量吸干净仓内的液体。
l 向仓内加入2mLTD（复合体依赖--检测液，内源性--TD），塞上塞子，这次不要塞到底，留出一段空气柱进行平衡，调整两边塞子高度尽量保持一致（若两边没有同时使用，拔出的高度一般以塑料扳手的厚度为宜）。转动转子，开始平衡，此时不用盖上盖子。
l 大约20-30 min后，可看到红色的平衡在0左右，蓝色的线平衡在200左右。（由于加入液体的氧含量不一样，最后平衡值可能变化。）
l 双击屏幕左下角和右下角各仓对应的O2 calib → Calibrate and copy to clipboard（这一步比较关键，容易遗漏！）
样本处理同3.2一致
4.4微量加样器的清洗和使用
l 每类药物有其专门的加样器，不要交叉使用。
l 吸去和打出药物时尽量垂直，减少误差。
l 清洗：取4个15 mL离心管，分别加入75%乙醇，95%乙醇，纯水，纯水。加样器依次在这4个离心管内清洗，每个离心管吹洗3次。
l 清洗完毕后应空打加样器，尽量排净里面液体，以免稀释药物。
l 每次加样结束后应立即清洗加样器，避免药物残留。
注意：使用加样器加入药物后需要在趋于平衡以后再拔出，吸取仓内液体时尽量远离电极方向，不要误戳电极；
4.5检测
以内源性氧呼吸为例
待氧流速稳定后读取细胞的基础氧呼吸值，用微量进样针向检测仓内加入
2μL 0.1 mM Oligomycin，读取氧呼吸值（与基础氧呼吸值的差值即为ATP依赖的氧呼吸值），加入3μL 0.1 mM FCCP，得到线粒体的最大呼吸容量，而后加入3μL 10 μM Antimycin A得到非线粒体呼吸值。平衡后记录数值。从仓内取200μL流式计数；
5.结果保存
导出耗氧量（OCR）数值
5.1打开数据文件进入O2k文件夹，选择目标数据文件并打开。
5.2数据均一化处理：点击菜单栏Layout →Standard layouts→ 选择 05a specific flux在右侧显示栏勾选Y2 O2 flow per cells，数据自动均一化，单位显示为 pmol/(s·million cells)。
5.3选取平台期数据:按住 Shift + 鼠标左键拖动选择平台期数据区间。点击区间上方横杠，弹出命名对话框，用英文命名（如Base-NC）。
5.4导出数据至Excel：点击 Marks→ 选择Flux/flow→all info；分别点击 A、B通道 → 右下角Copy to clipboard→ 粘贴到Excel；
有效数据行：仅 1A、1B中pmol/(s·million cells)为耗氧量数值 如下图
5.5数据分析：将3次重复实验的耗氧量数据制成柱状图（推荐使用Excel或GraphPad Prism ）
5.6重复性要求：每组实验需至少重复n≥3次，确保数据可靠性。
6.结束下机
实验结束后仓的清洗
6.1结束后先用纯水清洗3次，每次5 min。
6.2用75%乙醇清洗3次，每次5 min。
6.3然后用无水乙醇洗15 min。
6.4最后仓内加入75%乙醇，放入塞子，无需塞紧。塞子顶部也加满75%乙醇，盖上盖子。
6.5关闭软件，关闭仪器，刷卡下机；
